La colección permanente del museo está compuesta por más de 3 000 fondos, que permiten reconstruir la Historia de la Armada en la ciudad de Cartagena, desde la creación del Departamento Marítimo del Mediterráneo en 1728. Su variada naturaleza y tipología representa los diferentes campos y disciplinas de la historia naval y permite diseñar un recorrido a lo largo de una serie de áreas temáticas, que quedan distribuidas entre la sede principal y la Sala Isaac Peral de la siguiente forma:
Construcción Naval: espacio dedicado a la evolución de las técnicas constructivas desde el siglo XVIII al siglo XX, a través de un recorrido por los diferentes modelos de embarcaciones vinculadas con la Armada.
Navegación: área compuesta por una sección dedicada a la cartografía desde finales de la Edad Media y otra en la que se exponen diferentes instrumentos náuticos, la mayoría procedentes de buques de la Armada.
Artillería Naval y Armas Portátiles: muestra la evolución histórica del armamento utilizado en los antiguos navíos y buques de guerra, al igual que el armamento portátil y armas blancas de sus dotaciones.
Sanidad Naval: recoge las condiciones sanitarias y los avances médicos en la Real Armada. Se exponen diferentes materiales e instrumentos procedentes del antiguo Hospital de Marina de Cartagena y de la sección de Farmacia y Laboratorio de las dependencias militares.
Banderas y Uniformes: muestra la historia de las diferentes banderas utilizadas como símbolo nacional y su importancia como pabellón en los buques. La exposición de uniformes y sus complementos muestra la evolución histórica de la uniformidad en la Armada.
Pintura Naval: ofrece una selección de obras de tema naval que incluye escenas de buques, marinas, hechos históricos y retratos de personajes vinculados a la Armada.
Infantería de marina: área dedicada a este cuerpo militar de naturaleza naval creado en 1537, en la que se propone un recorrido por su historia a lo largo de las numerosas acciones navales o terrestres en las que ha participado, desde su creación a la actualidad.
Buceo: a finales del siglo XVIII se crean las primeras escuelas de buzos, siendo la de Cartagena una de las más antiguas del mundo. En esta sala se aborda la evolución de los sistemas de buceo desde el buzo clásico hasta el buceo autónomo y otros medios subacuáticos.
Armas submarinas: analiza su evolución desde finales del siglo XIX y a lo largo del XX, cuando el armamento naval experimenta un fuerte desarrollo. Cartagena tendrá un papel destacado en este campo como centro de referencia en la formación y construcción de unidades relacionadas con la guerra submarina.
Sala Isaac Peral: el espacio dedicado al submarino Peral se encuentra situado en el edificio colindante, antiguo Taller de Fundición del Arsenal. En su interior se exhibe el sumergible diseñado por Isaac Peral junto a una valiosa colección de objetos y recuerdos, que configuran el más completo legado del marino e inventor.
